Tehnologija PCR je tehnika pomnoževanja nukleinske kisline, ki posnema proces replikacije DNK in vitro.V glavnem ponavlja tri cikle: visokotemperaturno denaturacijo, nizkotemperaturno žarjenje in podaljšanje, nato pa milijonkrat pomnoži ciljno DNK.Tako ima tehnologija PCR to prednost, da je izjemno občutljiva.Vendar pa ima vsak kovanec dve plati in največja slabost tehnologije PCR je, da je zelo dovzetna za kontaminacijo in zelo majhna količina kontaminacije lahko privede do lažno pozitivnih rezultatov.
Ko pride do kontaminacije laboratorijske nukleinske kisline, je treba običajne poskuse ustaviti.Nato so potrebni znatni materialni in človeški viri, dokler se ne najde vir kontaminacije ali pa je čistoča laboratorija v skladu s standardi.Poleg tega je treba laboratorijsko poročilo razveljaviti.Rezultati so zanesljivi šele po ponovnem poskusu.
Da bi se učinkovito izognili kontaminaciji in pridobili stabilne in zanesljive rezultate testov, moramo pogosto sprejeti določene ukrepe za preprečevanje ali odpravo kontaminacije v praksi.
pcr plošča
Viri kontaminacije.
Kontaminacija z reagentom
Ker so posode za reagente, posode, voda in druge raztopine lahko kontaminirane z nukleinskimi kislinami med pripravo reagentov PCR.
Kontaminacija opreme
Polavtomatski ekstraktorji nukleinske kisline in popolnoma avtomatski ekstraktorji nukleinske kisline lahko povzročijo, da se vzorci ali predloge nukleinske kisline med ekstrakcijo razlijejo in kontaminirajo stroj.Ali pa smetnjak v opremi ni temeljito očiščen in preostala tekočina ali kristali izhlapijo in tvorijo aerosole, kar lahko povzroči kontaminacijo.
Navzkrižna kontaminacija vzorca
Navzkrižno kontaminacijo vzorcev lahko povzročijo številni dejavniki: kontaminacija posode za zbiranje vzorcev;razlitje posode zaradi slabega tesnjenja pri namestitvi vzorca;vzorci se držijo zunanje strani posode;kontaminacija inhalatorja in aerosolov v zraku.Zlasti virusi se lahko širijo z aerosoli ali z tvorbo aerosolov, kar povzroči medsebojno okužbo.
Kontaminacija produkta PCR
To je najpogostejša težava kontaminacije pri PCR.Običajno ga najdemo v testih, ki zahtevajo odpiranje po pomnoževanju ali nepravilno ravnanje z izdelkom po pomnoževanju.To je zato, ker je velikost kopije izdelka PCR veliko večja od največjega števila kopij, ki jih zazna PCR.Zato lahko zelo majhna količina kontaminacije produkta PCR povzroči lažno pozitiven rezultat.
Kontaminacija s plazmidom kloniranja
Pozitivne reference se običajno uporabljajo v laboratorijskih operacijah in večina teh pozitivnih referenc prihaja iz določenih kloniranih plazmidov.Koncentracija kloniranih plazmidov na prostorninsko enoto je zelo visoka in se lahko zlahka kontaminirajo, če se ne uporabljajo previdno.
Nekateri laboratoriji klonirajo lastne plazmide kot izdelke za nadzor kakovosti.Vendar pa se po pripravi z odpadki ne ravna dovolj strogo, kar vodi do kontaminacije laboratorija s plazmidi in s tem vzorcev.
Ukrepi za nadzor kontaminacije
Eksperimentalna kompartmentalizacija
Racionalno ločevanje laboratorijev.Delite ali razdelite delovanje naslednjih korakov: obdelava vzorca, priprava reakcijske raztopine PCR, pomnoževanje cikla PCR, identifikacija produkta PCR itd. Poleg tega je treba posebno pozornost nameniti dejstvu, da je treba obdelavo vzorca in identifikacijo produkta PCR ločiti od drugi koraki.
Najbolje jih je razdeliti na: območje za obdelavo vzorca, območje za pripravo reakcijske raztopine PCR, območje za pomnoževanje cikla PCR in območje za identifikacijo produkta PCR.Uporabljati je treba izključno njihove laboratorijske pripomočke in aspiratorje.
UV, ki se uporablja v laboratoriju, je treba pred poskusom sterilizirati, da se uniči preostala DNK ali RNK.
Artikli za vsako cono se ne smejo mešati
Vsako laboratorijsko območje mora biti jasno označeno z različno opremo in predmeti v vidni barvi, da se prepreči mešanje opreme in predmetov iz različnih delovnih področij.Na primer delovna oblačila, delovni čevlji, smetnjaki, krpe, krpe, peresa itd., ki se uporabljajo izključno na vsakem območju.
Uporabljajte pipete za enkratno uporabo, centrifugalne epruvete, rokavice brez prahu, maske itd.
Vzpostavite standardni klimatski in prezračevalni sistem
Kadar koli je to mogoče, uporabite popolne klimatske sisteme za dovajanje in izpušne klimatske sisteme.Med dostopom do vsakega delovnega območja je potrebna stroga enotna smer pretoka, tj. območje za pripravo in shranjevanje reagenta → območje za pripravo vzorca → območje za pomnoževanje PCR → območje za analizo produkta pomnoževanja, brez retrogradnega pretoka.
Spremljanje kontaminacije
Monitoring kontaminacije izvajamo z naslednjimi ukrepi: vzpostavitvijo pozitivnih in negativnih kontrol, ponavljanjem testov, izbiro primerjev za različne regije za pomnoževanje PCR ipd., s čimer izvajamo ukrepe za preprečevanje in odpravo kontaminacije.
Redno čiščenje laboratorija
Pripravite raztopino razkužila, ki vsebuje 0,5 % aktivnega klora, za brisanje površin opreme, pultov, tal, površin artiklov, prehodov, vrat in oken ter namočite smetnjake v opremo.
Škropljenje z alkoholom v zrak se izvaja po principu od zgoraj navzdol, znotraj navzven.
Pipete, centrifuge z osmimi epruvetami, stresalne mešalnike in drugo majhno opremo obrišite z alkoholom (75 %).
Obrišite površine opreme, pulte in tla s prečiščeno vodo in sperite rezervoarje za odpadno opremo s prečiščeno vodo.
Prevedeno z www.DeepL.com/Translator (brezplačna različica)
Čas objave: 28. september 2022