Kvantitativni PCR s fluorescenco v realnem času je metoda za merjenje skupne količine produkta po vsakem ciklu verižne reakcije s polimerazo (PCR) v reakciji pomnoževanja DNK z uporabo fluoroforja.Metoda se uporablja za kvantifikacijo specifičnih zaporedij DNK v vzorcu, ki se testira z notranjimi ali zunanjimi referenčnimi metodami.Fluorescentni kvantitativni PCR testi so od svojega začetka postali vse bolj priljubljeni pri učiteljih laboratorijev.
Načelo fluorescenčne PCR: Fluorescenčna PCR, najprej imenovana TaqManPCR in pozneje tudi Real-TimePCR, je nova tehnika kvantifikacije nukleinske kisline, ki jo je leta 1995 razvil PE (PerkinElmer) v ZDA. Tehnika temelji na dodajanju fluorescentno označene sonde ali ustrezne fluorescenčnega barvila na konvencionalni PCR, da doseže svojo kvantitativno funkcijo.Načelo: med potekom reakcije PCR se produkti reakcije PCR kopičijo in intenzivnost fluorescenčnega signala narašča v enakem razmerju.Z vsakim ciklom se zbere signal intenzitete fluorescence, tako da lahko spremljamo spremembo količine produkta s spremembo intenzitete fluorescence in tako dobimo graf krivulje ojačanja fluorescence.
Na splošno lahko krivuljo ojačanja fluorescence razdelimo na tri faze: fazo signala fluorescenčnega ozadja, fazo eksponentnega ojačanja fluorescenčnega signala in fazo platoja.Med fazo signala ozadja je ojačani fluorescenčni signal prikrit s fluorescenčnim signalom ozadja in sprememb v količini produkta ni mogoče določiti.V fazi platoja produkt pomnoževanja ne narašča več eksponentno, ni linearne povezave med količino končnega produkta in količino začetne predloge, števila začetnih kopij DNK pa ni mogoče izračunati na podlagi končne količine produkta PCR.Le v fazi eksponentnega pomnoževanja fluorescentnega signala obstaja linearna povezava med logaritmom količine produkta PCR in količino začetne predloge, na tej stopnji pa se lahko odločimo, da to kvantificiramo.Za lažjo kvantifikacijo in primerjavo sta bila v tehniko fluorescentne kvantitativne PCR v realnem času uvedena dva zelo pomembna koncepta: prag fluorescence in vrednost CT.
Prag je umetno nastavljena vrednost na krivulji ojačanja fluorescence.eksponentna faza pomnoževanja PCR.
Vrednost Ct: je število ciklov, ki jih je prestal fluorescenčni signal v vsaki reakcijski epruveti, da je dosegel nastavljeno vrednost domene.
Razmerje med vrednostjo Ct in začetno predlogo: študije so pokazale, da je vrednost Ct vsake predloge v linearnem razmerju z logaritmom začetnega števila kopij te predloge; več kot je kopij začetnega števila kopij, manjši je Ct vrednost.Vrednosti Ct so relativno stabilne.Standardno krivuljo je mogoče narediti z uporabo standarda z znanim številom začetne kopije, kjer vodoravna koordinata predstavlja logaritem števila začetne kopije, navpična koordinata pa vrednost Ct, kot je prikazano na spodnji sliki.
Zato je mogoče s pridobitvijo vrednosti Ct neznanega vzorca iz standardne krivulje izračunati začetno število kopij tega vzorca.
Vrednost Ct ni konstantna in nanjo lahko vplivajo različni vzorci in različni instrumenti, tudi če se isti vzorec dvakrat ponovi na istem instrumentu, se lahko vrednost Ct spreminja.
Kvantitativni testi fluorescence: Kvantitativne teste fluorescence lahko razdelimo na fluorescenčne sonde in fluorescenčna barvila, odvisno od uporabljenih markerjev.Fluorescentne sonde vključujejo tehnologijo Beacon (tehnologija molekularnih svetilnikov, ki jo zastopa American Tagyi), sonde TaqMan (ki jo zastopa ABI) in tehnologijo FRET (ki jo zastopa Roche);fluorescentna barvila vključujejo nasičena fluorescentna barvila in nenasičena fluorescentna barvila, tipičen predstavnik nenasičenih fluorescentnih barvil je SYBRGreen I, ki se zdaj pogosto uporablja;nasičeno Tipičen predstavnik nenasičenih fluorescentnih barvil je SYBRGreenⅠ;nasičena fluorescentna barvila so EvaGreen, LCGreen itd.
SYBRGreenI je pogosto uporabljeno barvilo za vezavo DNA za fluorescentno PCR, ki se nespecifično veže na dvoverižno DNA.V prostem stanju SYBRGreenI oddaja šibko fluorescenco, ko pa se veže na dvoverižno DNK, se njegova fluorescenca poveča za 1000-krat.Zato je skupni fluorescenčni signal, ki ga oddaja reakcija, sorazmeren s količino prisotne dvoverižne DNA in narašča, ko se povečuje produkt pomnoževanja.
Prednosti barvil za vezavo dvoverižne DNA: enostavna eksperimentalna zasnova, potrebna sta samo 2 primerja, ni potrebe po načrtovanju sond, ni potrebe po načrtovanju več sond za hitro testiranje več genov, možnost izvedbe analize krivulje tališča, testiranje specifičnosti reakcija ojačanja, nizki začetni stroški, dobra splošnost in se zato pogosteje uporabljajo v raziskavah doma in v tujini.
Metoda s fluorescenčno sondo (Taqmanova tehnika): Ko se izvede PCR pomnoževanje, se skupaj s specifično fluorescenčno sondo doda par primerjev.Ko je sonda nedotaknjena, fluorescenčni signal, ki ga oddaja reporterska skupina, absorbira ugasnjena skupina in ga instrument PCR ne zazna;med pomnoževanjem PCR (v ekstenzijski fazi) 5'-3' cepitvena aktivnost encima Taq encimsko razgradi sondo, tako da nastane reporterska fluorescenčna skupina in ugasnjena fluorescenčna skupina
Uporaba fluorescentne kvantitativne PCR.
Raziskave molekularne biologije:
1. Kvantitativna analiza nukleinske kisline.Kvantitativna in kvalitativna analiza nalezljivih bolezni, odkrivanje patogenih mikroorganizmov ali virusov, kot je nedavna epidemija gripe A (H1N1), odkrivanje števila genskih kopij transgenih rastlin in živali, odkrivanje stopenj inaktivacije genov RNAi itd.
2. Analiza diferencialne genske ekspresije.Primerjava razlik v ekspresiji genov med tretiranimi vzorci (npr. zdravljenje z zdravili, fizična obdelava, kemična obdelava itd.), razlik v ekspresiji specifičnih genov v različnih fazah in potrditev rezultatov mikromrež cDNA ali diferencialne ekspresije
3. Odkrivanje SNP.Odkrivanje polimorfizmov posameznega nukleotida je pomembno za preučevanje individualne dovzetnosti za različne bolezni ali individualnega odziva na specifična zdravila, zaradi domiselne strukture molekularnih svetilnikov pa je, ko je informacija o zaporedju SNP znana, enostavno in natančno določiti uporabite to tehniko za visoko zmogljivo odkrivanje SNP.
4. Detekcija metilacije.Metilacija je povezana s številnimi človeškimi boleznimi, zlasti z rakom, in Laird je poročal o tehniki, imenovani Methyllight, ki obdela DNA pred pomnoževanjem, tako da nemetiliran citozin postane uracil, metilirani citozin pa ostane nespremenjen, z uporabo posebnih primerjev in Taqmanovih sond za razlikovanje med metilirano in nemetilirano DNA .bolj občutljiva.
Medicinske raziskave:
1. Prenatalna diagnostika: ljudje ne morejo zdraviti dednih bolezni, ki jih povzroča spremenjen genski material, in zaenkrat lahko le zmanjšajo število bolnih otrok, rojenih s predporodnim spremljanjem, da bi preprečili pojav različnih dednih bolezni.To je neinvazivna metoda, ki jo nosečnice zlahka sprejmejo.
2. Odkrivanje patogenov: fluorescentni kvantitativni PCR test omogoča kvantitativno določanje patogenov, kot so gonokok, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, humani papiloma virus, virus herpes simplex, virus humane imunske pomanjkljivosti, virus hepatitisa, virus influence, Mycobacterium tuberculosis, EBV in citomegalovirus.V primerjavi s tradicionalnimi metodami testiranja ima prednosti visoke občutljivosti, majhne velikosti vzorca, hitrosti in preprostosti.
3. Ocena učinkovitosti zdravil: kvantitativna analiza virusa hepatitisa B (HBV) in virusa hepatitisa C (HCV) kaže, da je razmerje med virusno obremenitvijo in učinkovitostjo določenih zdravil.Če se serumska raven HBV-DNA med zdravljenjem z lamivudinom zmanjša in nato ponovno zviša ali preseže prejšnjo raven, je to znak mutacije virusa.
4. Onkogenetsko testiranje: Čeprav mehanizem razvoja tumorja še ni jasen, je splošno sprejeto, da so mutacije v ustreznih genih osnovni vzrok onkogene transformacije.Povečano izražanje in mutacijo onkogenov je mogoče opaziti v zgodnjih fazah številnih tumorjev.Kvantitativni PCR s fluorescenco v realnem času ni učinkovit le pri odkrivanju mutacij v genih, ampak lahko tudi natančno odkrije izražanje onkogenov.Ta metoda je bila uporabljena za odkrivanje izražanja različnih genov, vključno z genom telomeraze hTERT, genom WT1 za kronično granulocitno levkemijo, onkogenim genom ER, genom PSM za rak prostate in virusnimi geni, povezanimi s tumorjem.
Prevedeno z www.DeepL.com/Translator (brezplačna različica)
Čas objave: 21. junija 2022