1. Če prejmem epruveto z zamrznjenimi celicami, ali jo lahko dam neposredno v tekoči dušik za shranjevanje?
V mnogih primerih lahko celice, prepeljane na suhem ledu (-80 °C), damo nazaj v tekoči dušik in nato hitro odmrznemo.Vendar se lahko sposobnost preživetja celic po takem zdravljenju zmanjša.Pri nekaterih občutljivih celičnih linijah lahko to oteži okrevanje celic.Ta pojav naj bi bil posledica spremembe v strukturi ledenih kristalov v celicah zaradi temperaturnih sprememb.Zato je priporočljivo, da se celice čim prej po prejemu odmrznejo in gojijo.Skrajšajte čas skladiščenja pri -80°C.Ta temperatura se uporablja samo za transport.
2. Katere varnostne ukrepe je treba upoštevati pri odstranjevanju celic iz tekočega dušika za predelavo?
Celične krioepruvete v tekočem dušiku, ki niso popolnoma zaprte in vanje izteka tekoči dušik, lahko povzročijo eksplozijo, če temperatura krioepruvete pri odmrzovanju močno naraste.Zato je priporočljivo, da pri odstranjevanju celic iz tekočega dušika nosite zaščitna očala in zaščitne rokavice.Za oživljanje je treba zamrzovalno epruveto nenehno stresati v vodni kopeli pri 37 °C, da se raztopina za zamrzovanje v 1-2 minutah popolnoma odtali.Nato obrišite zunanjost epruvete z alkoholnim robčkom, nato jo odnesite na ultra čisto mizo in celice prenesite v epruveto za centrifugiranje z dodanim 10 ml gojišča, centrifugirajte pri 1000 obratih na minuto 5-10 minut, zavrzite supernatant, dodamo ustrezno količino gojišča in inokuliramo bučko za kulturo ter inkubiramo v inkubatorju s 5 % CO2.
3. Zakaj bi morale biti celice shranjene v parni fazi posode s tekočim dušikom namesto v tekoči fazi?
Celice, shranjene v plinski fazi tekočega dušika, bodo bolj verjetno oživele.Medtem ko lahko v tekoči fazi tekočega dušika, če cevi za liofilizacijo niso pravilno zaprte ali puščajo, neposreden stik med celicami in tekočim dušikom ogrozi sposobnost preživetja celic po odtajanju.
4. Kako zamenjam gojišče za suspenzijske celice?
Gojenje suspenzijskih celic lahko izvedete s preprostim dodajanjem svežega medija (če prostor dopušča) ali z ločitvijo celic od starega medija s centrifugiranjem (100 xg 5 minut) in nato resuspendiranjem oborjenih celic v svežem mediju.Vendar pa je za večino suspenzijskih celičnih linij preprosto dodajanje medija boljša metoda.V vsakem primeru je treba medij obnoviti, preden celice dosežejo največjo gostoto nasičenosti.Gostota nasičenosti celic se giblje med 3 x 10 5 in 2 x 10 6, odvisno od celične linije in pogojev gojenja (mirovanje ali mešanje, ravni oksigenacije itd.).Celice je treba razredčiti na nižjo koncentracijo celic, da se omogoči zadostna obnovitev hranil, da se ohrani logaritmična rast celic.Če gojišče preprosto zamenjamo, ne da bi zmanjšali gostoto celic, bodo celice medij hitro izčrpale in odmrle.Če so celice razredčene pod njihovo najmanjšo gostoto, bodo prešle v fazo zamika in rasle zelo počasi ali pa bodo odmrle.Vsaka suspenzijska celična linija ima drugačno gostoto nasičenosti in interval prehoda, zato je dnevno število celic način za spremljanje suspenzijskih celičnih linij*.
5. Kakšna je priporočena raven CO2 za celično kulturo?
Čeprav se ravni CO2 v sistemih celične kulture gibljejo od 0,03 % do 40 % (običajno okoli 0,03 % CO2 v ozračju), je zelo pogosto, da zraku ni dodanega CO2 ali pa je koncentracija CO2 od 5 % do 10 %.Pomembno je prilagoditi koncentracijo natrijevega bikarbonata v mediju, da se uravnoteži z nivojem CO2 v plinski fazi.Celice proizvajajo CO2 in potrebujejo majhno količino ogljikove kisline za rast in preživetje.Če CO2 ni dodan in se celice množijo, lahko uporabimo 4 mM (0,34 g/L) brezvodnega natrijevega bikarbonata.Vendar je treba na tej točki zategniti pokrov bučke za kulturo.Če sistem kulture zahteva 5 % ali 10 % CO2, uporabite 23,5 mM (1,97 g/L) oziroma 47 mM (3,95 g/L) natrijevega bikarbonata pri 37 °C z začetnim pH približno 7,6.Pod temi pogoji je treba bučko pustiti nepokrito ali pa uporabiti petrijevko za vzdrževanje plinskega ravnovesja.
6. Zakaj nekatere celice potrebujejo natrijev piruvat?Koliko natrijevega piruvata naj dodam mediju?
Piruvat je metabolit organske kisline v glikolitični poti*, ki zlahka vstopi v celico in jo zapusti.Zato dodatek natrijevega piruvata mediju zagotavlja tako vir energije kot vir ogljika za anabolizem, pomaga vzdrževati določene specifične celice, pomaga pri kloniranju celic ali je potreben, ko so serumske koncentracije v mediju zmanjšane.Natrijev piruvat prav tako pomaga zmanjšati citotoksičnost, ki jo povzroča fluorescenca.Natrijev piruvat se običajno doda v končni koncentraciji 1 mM.komercialno dostopne raztopine natrijevega piruvata so običajno 100 mM raztopina za shranjevanje (100X).
Prevedeno z www.DeepL.com/Translator (brezplačna različica).
Čas objave: 21. junija 2022